肺结核为结核分枝杆菌感染所致呼吸系统疾病，其临床表现主要以咳嗽、咳痰或咯血为主。因早期缺乏特异性症状，往往被误认为其他呼吸系统疾病。临床中多数患者经病理诊断确诊时，已处于严重阶段^[1]。肺结核严重损害患者肺功能，随结核分枝杆菌对其他组织器官侵袭，可诱发呼吸困难、骨关节功能障碍及脑膜刺激症等严重并发症。又因肺结核具有传染性，不仅需要采取科学有效的临床诊治工作，还需要重视早期诊断工作开展。临床中针对肺结核的诊断方法主要以X-Pert检测以及BD960液体培养为主，但X-Pert对检验人员专业素养以及实验室环境要求较高，检验结果极易受到诸多因素影响。BD960液体培养周期相对较长，对于已经处于肺结核感染且出现明显临床症状的患者，待检验结果检出可能延误最佳治疗周期。纳米孔技术的出现为肺结核诊断带来新思考，纳米孔测序技术通过确定碱基信息并与数据库对比从而鉴定物种信息，因具有实时测序、更高通量及读长特点，在肺结核诊断中可能发挥重要效果^[2]。基于此，本研究着重探究纳米孔测序技术等不同检测技术的应用价值。

1、一般资料与方法

1.1一般资料

本院2023年6月至2023年12月接受临床检查的130例疑似患者。男女比70:60，年龄35～65岁，平均（49.86±7.21）岁。体质量指数20.2～27.1kg/m²，平均（24.13±0.97）kg/m²。患者均同意，符合本院伦理委员会批准。

1.2 纳入与排除标准

纳入标准：符合《肺结核诊断标准(WS 288-2017)》^[3]对肺结核诊断标准；受检者存在咳嗽及咳痰症状持续14d以上，且伴有咳中带血；认知功能正常且能够配合量表填写；临床资料完整。

排除标准：恶性肿瘤；全身炎症性疾病；肝肾功能重度衰竭；合并其他肺部疾病；因特殊原因无法采集合格样本。

1.3方法

1.3.1 X-Pert检测

入院后拍摄胸部CT，根据检查结果选择受检肺段支气管。局麻处理后，通过纤维支气管镜到达支气管开口处，注入30ml0.9%氯化钠溶液，多次注入总量不超过300ml。负压吸引回收黏液至无菌瓶，离心1200r/min处理待检。取1ml黏液与前处理管，添加2ml氢氧化钠及异丙醇处理液并涡轮震荡20s。静置处理后吸取2ml样本加入采用X-Pert检测配套反应盒，并放入X-Pert检测系统读取阳性阴性结果。阳性阴性判断标准：硬结直径＜5mm提示阴性、硬结直径为5～19mm提示阳性。

1.3.2 BD960液体培养

通过雾化取痰获得痰样本，取2ml样本置于前处理管。于管内加入4ml4%氢氧化钠溶液，涡轮震荡30s后静置15min。利用2ml移液管加磷酸盐缓冲液至沉淀物，确定体积为2.5ml并涡旋振荡处理3s。将0.5ml混合物置于MGIT管中，剩余混悬液分散至冻存管中，确定接种管未污染。阳性阴性判断标准：若每ml培养基中存在10⁵～10⁶菌落构成单元则为阳性，若6周后依旧无菌落则为阴性。

1.3.3 纳米孔测序技术

要求患者在医护人员指导下用生理盐水漱口2次，若有假牙则提前取下假牙。要求患者用力咳嗽确保深部痰液顺利排出，收集3ml即可，收集痰液样本期间切勿误收集唾液或鼻腔分泌物。倘若患者排痰困难，可采用吸痰器辅助吸引。样本收集完毕后放置于4℃环境待检，若当天无法送检则置于20℃冰箱留存7d。处理前观察痰液样本性质，若痰液黏度过高则根据黏稠程度分级采用合适体积的液化液及合理液化时间处理，确保微生物核酸完整性。分别经蛋白酶K、融化细菌酶及质粒等前处理后，进行核酸提取。待痰样本与试剂反应后通过无水乙醇清洗离心处理，并经由磁珠处理及洗涤。因检测对象为结核分枝杆菌，需确保其破壁效果。同时设置阳性对照以及阴性对照，避免人为操作步骤或者实验室环境污染影响检出结果。提取核酸样本后进行核酸质量验证：要求高纯度DNA的260nm/280nm波长处吸光值控制为1.7～1.9范围，260nm/230nm波长处吸光值＞2.0。于Qubit4.0仪器进行荧光染料定量测定，若核酸含量较低则重新提取，确保符合检验要求。进行PCR反应，纯化处理并提取DNA文库，标记多重PCR产物。为提高数据产出效率，进行PCR扩增和片段化处理。建库完成后采用Qubit荧光染料法检测文库浓度，完毕后检查纳米孔测序芯片质量，若为初次使用则芯片可用孔数＞800，最低标准则为50孔数。通过NanoStats软件统计测序数据量，通过minimap2软件将纳米孔测序序列与美国国家生物技术信息中心RefSeq数据库对比，鉴定物种信息。阳性阴性判断标准：ROC曲线确定已知结果临床样本训练集最佳阈值，通过NTC样本监控背景菌以此排除环境菌、共生菌及条件致病菌对结果影响。采用独立判断标准，检出1条特异序列即可判断为阳性，若无特异序列则为阴性。

1.4 观察指标

诊断效能：分别分析纳米孔测序技术、X-Pert检测以及BD960液体培养单一指标和指标联合诊断的敏感度、特异度及准确度。

1.5统计学分析

软件包（SPSS 24.0）数据统计。计数资料检验效能%表示，χ²检验。P<0.05差异显著。

2、结果

2.1 诊断对比

以临床病理诊断作为金标准，发现130例疑似肺结核患者中阳性55例、阴性75例。联合检验阳性53例、阴性71例。见表1。

表1 诊断对比（n,%）

2.2 诊断效能对比

纳米孔测序技术敏感度76.36%、特异度80.00%及准确度78.46%高于X-Pert检测和BD960液体培养，联合检验的敏感度96.36%、特异度94.67%及准确度95.38%均高于其他单一指标检验。见表2。

表2 诊断效能对比（n,%）

3、讨论

结核分枝杆菌感染所致的肺结核严重威胁患者生命健康，可诱发多种严重并发症甚至出现不良结局。因该疾病缺乏早期特异症状，导致其难以及时诊断预防，从而推动疾病进展。为解决这一现实困境，不仅需要重视针对性治疗方案的制定，还需要通过早期诊断及时发现疾病发生及进展情况，以此后后续治疗工作开展提供关键支持。目前肺结核诊断主要采取X-Pert检测、BD960液体培养等。其中BD960液体培养基检测时间相对较长，可能导致疾病进展错过最佳治疗周期。X-Pert检测虽然具有较高的灵敏度及特异度，但对检验医师及环境要求较高，可能受诸多因素影响诊断效能。纳米孔测序技术的出现推动肺结核诊断朝着数字化、智慧化方向发展，该技术可精准识别受检样本中核苷酸排列情况，通过对比分析的方式确定是否为结核分枝杆菌^[4]。该技术在此类患者群体的早期诊断中可能具有重要应用效果。

研究结果显示，纳米孔测序技术敏感度76.36%、特异度80.00%及准确度78.46%高于X-Pert检测和BD960液体培养，联合检验的敏感度96.36%、特异度94.67%及准确度95.38%均高于其他单一指标检验。与赵春艳^[5]等人研究相似，原因如下：传统检验技术受限于检验周期、人为及环境因素影响，往往存在假阳性或者假阴性出现。近些年随着基因组学技术的高速发展，第三代测序技术中的纳米孔测序为肺结核早期诊断工作开展带来重要技术支持。该技术实现了单分子检测与电信号传导的有机融合，通过接头马达蛋白可解开双链核酸，并在电场力下穿过纳米蛋白孔道。由于不同结构碱基在穿过孔道过程中产生的电信号均有所差异，因此通过测序仪记录不同电信号以此推断碱基信息。并通过核对核酸分子序列，实现对受检样本的精准检测。从检测序列开看，纳米孔测序技术可支持最长4.2Mb序列，因能规避基因组复杂区域影响，可以精准识别复杂的病原微生物未知结构变异。并且测序期间并不依赖于RCR扩增，能够有效避免序列扩增的偏好性对原始碱基修饰信息的影响。上述多种检测技术联合应用，能够有效规避不同检测技术弊端问题，从而获得更为显著的诊断效能。

综上所述，本研究发现纳米孔测序技术诊断肺结核具有较高诊断效能，而在此基础上联合X-Pert检测、BD960液体培养可进一步提高诊断效能。需注意的是，为进一步提高临床应用效果，对于结核分枝杆菌等可采用较长读长的纳米孔测序提高特异性。

参考文献：

[1]王烁程,张林波.结核病实验室检测技术研究进展[J].中国动物检疫,2020,37(3):78-85.

[2]Cabibbe AM, Moghaddasi K, Batignani V,et al. Nanopore-based targeted sequencing test for direct tuberculosis identification, genotyping, and detection of drug resistance mutations: a side-by-side comparison of targeted next-generation sequencing technologies[J]. J Clin Microbiol. 2024 Oct 16;62(10):e0081524.

[3]中华人民共和国国家卫生和计划生育委员会.肺结核诊断标准(WS 288-2017)[J].新发传染病电子杂志,2018,3(1):59-61.

[4]许静,王伟,李团团.结核分枝杆菌特异性IFN-γ、IL-2联合检测在肺结核与细菌性肺炎鉴别诊断中的应用[J].中国感染控制杂志,2024,23(9):1173-1177.

[5]赵春艳,宋畅,宋树林,等. 纳米孔测序检测痰液样本在肺结核诊断中的应用[J].中国临床医生杂志,2024,52(4):413-416.